style="width:3.66665in;height:0.67342in" /> (1) 本文是学习GB-T 14701-2019 饲料中维生素B2的测定. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了饲料中维生素 B₂ (即核黄素C₁H₂N₁₀)
测定的荧光分光光度法和高效液相色谱法。
本标准方法1适用于动物性和植物性饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中维生素 B2 的测定，定量限为
本标准方法2适用于维生素预混合饲料、复合预混合饲料、浓缩饲料中维生素 B₂
的测定，以荧光检
测器检测时，定量限为5 mg/kg; 以紫外检测器检测时，定量限为10 mg/kg。
浓缩饲料中维生素 B₂
的测定，方法1为仲裁法；维生素预混合饲料、添加剂预混合饲料中维生素
B2 的测定，方法2中的高效液相色谱荧光检测器方法为仲裁法。
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GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 14699.1 饲料 采样
GB/T 20195 动物饲料 试样的制备
维生素 B.(核黄素)在440 nm
紫外光激发下产生绿色荧光，在一定浓度范围内其荧光强度与核黄
素含量成正比。用连二亚硫酸钠还原核黄素成无荧光物质，由还原前后荧光强度之差与荧光强度的比
值计算样品中维生素B2 的含量。
除非另有说明，所用试剂均为分析纯试剂，水为蒸馏水，符合 GB/T 6682
中三级用水或相当纯度
的水。
3.2.1 氢氧化钠溶液：0.05 mol/L。
3.2.2 氢氧化钠溶液：1.0 mol/L。
3.2.3 盐酸溶液：0.1 mol/L。
3.2.4 盐酸溶液：1.0 mol/L。
3.2.5 连二亚硫酸钠(Na₂S₂O₄)。
3.2.6 高锰酸钾溶液：40 g/L。
3.2.8 冰乙酸溶液，0.02 mol/L: 将1.8 mL 冰乙酸用水稀释至1000 mL。
3.2.9 过氧化氢溶液，100 mL/L, 分析当天制备。
3.2.10 维生素 B₂ 标准溶液
GB/T 14701—2019
3.2.10.1 维生素 B2 贮备液 I:
称取在五氧化二磷干燥器里干燥24 h 的维生素 B2 标准品(纯度大于 95%)25
mg(精确至0.0001 g)于250 mL 棕色锥形瓶中，加入约200 mL
冰乙酸溶液(3.2.8),在沸水浴 中煮沸直至溶解，冷却后转移至250 mL
棕色容量瓶中，用冰乙酸溶液(3.2.8)稀释至刻度。滴加甲苯覆
盖，2℃~8℃冰箱保存，保存期6个月。该溶液含0.1 mg/mL 维生素 B2。
3.2.10.2 维生素 B₂ 贮备液Ⅱ:取维生素 B₂ 贮备液
I(3.2. 10. 1)10 mL 用冰乙酸溶液(3.2.8)稀释至
100
mL,置于棕色容量瓶中滴加甲苯覆盖，2℃~8℃冰箱保存，保存期3个月。该溶液中含10μg/mL
维生素 B₂。
3.2.10.3 维生素 B2 标准工作液：取维生素B₂
贮备液Ⅱ(3.2.10.2)10 mL, 用水稀释至100 mL, 分析前
制备。该溶液中含1μg/mL 维生素 B₂。
3.2.11 荧光素标准溶液
3.2.11.1 荧光素贮备液：称取荧光素0.050 g,
用水稀释至1000 mL, 置于棕色瓶中2℃~8℃冰箱保 存。该溶液中含50μg/mL
荧光素。
3.2.11.2 荧光素标准工作液：取1 mL
荧光素贮备液(3.2.11.1),用水定容至1000 mL, 置于棕色瓶中
2℃~8℃冰箱保存。该溶液中含0 .05μg/mL 荧光素。
3.2.12 溴甲酚绿 pH 指示剂
取溴甲酚绿0 . 1 g, 加氢氧化钠溶液(3.2. 1)2.8 mL 溶解，再加水稀释至200
mL。 变 色 范 围
pH 3.6～5.2。
3.3.1 分析天平：感量0.0001 g。
3.3.3 具塞玻璃刻度试管：15 mL。
按 GB/T14699.1 的规定，选取具有代表性的样品至少500 g,
用四分法缩减至100 g; 按
GB/T 20195 的规定制备样品，磨碎，通过0.425 mm
孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存备用。
以下操作应避免强光照射。
称取饲料原料、配合饲料、浓缩饲料1 g～2g (精确至0.001 g)置于100 mL
棕色具塞锥形瓶中。加 入 6 5 mL 盐酸溶液(3.2.3),于沸水浴中煮沸30 min。
在加热开始时，每隔5 min～10 min 摇动锥形瓶
一次，以防试样结块。冷却至室温后，用氢氧化钠溶液(3.2.2)调节 pH
值至6.0～6.5,立即加盐酸溶液
(3.2.4)使 pH 值调至4.5(溴甲酚绿指示剂变为草绿色)。转移至100 mL
棕色容量瓶中，用水稀释至刻
度。通过中速无灰滤纸过滤，弃去最初5 mL～10mL 溶液，收集滤液于100 mL
棕色锥形瓶中。取整
份清液，滴加稀盐酸检查蛋白质，如有沉淀生成，继续加氢氧化钠溶液，剧烈振摇使之沉淀完全。再次过
滤作为待测试液
于 a、b、c三支15 mL 刻度试管(3.3.3)中各吸入试样溶液(3.5.1)10 mL,
同时做平行，向试管 a 中加
入 水 1 mL, 向试管 b 中加入维生素 B₂ 标准工作液(3.2.10.3)1 mL。
然后各加入冰乙酸(3.2.7)1 mL,
GB/T 14701—2019
旋摇混匀后逐个加高锰酸钾溶液(3.2.6)0.5 mL, 旋摇混匀，静置2 min,
再逐个加入过氧化氢溶液
(3.2.9)0.5mL 旋摇，使高锰酸钾颜色在10 s 内消退。加盖摇动，使气泡逸出。
用荧光素标准工作液(3.2.11.2)调整荧光仪，使其稳定于一定数值，作为仪器工作的固定条件。调
整激发波长440 nm, 发射波长525 nm, 测定试管a、试管 b
的荧光强度，试样溶液在仪器中受激发照射 不超过10 s; 在试管c 中加入20 mg
连二亚硫酸钠(3.2.5),摇动溶解，并使试管中的气体逸出，迅速测定
其荧光强度作为荧光空白。若溶液出现浑浊，不能读数。
试样中维生素 B₂ 的含量w; 以质量分数表示，单位为毫克每千克(mg/kg),
按式(1)计算：
style="width:3.66665in;height:0.67342in" /> (1)
式中：
T,—— 试管 a (试液加水)的荧光强度；
T₂— 试管 b (试液加标样)的荧光强度；
T₃—— 试管 c(试液加连二亚硫酸钠)的荧光强度；
mo—— 加入维生素 B₂ 标样的量，单位为微克(μg);
V — 试液的初始体积，单位为毫升(mL);
V₁— 测试时分取试液的体积，单位为毫升(mL);
m — 试样质量，单位为克(g);
n - 稀释倍数；
style="width:0.98003in;height:0.67342in" />值应在0.66～1.5,否则需调整样液的浓度，调整称样量或者稀释倍数。
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
对于维生素 B₂ 含量低于5 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术平
均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的15%;
对于维生素 B₂ 含量大于5mg/kg 而小于50 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测
定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%;
对于维生素 B₂ 含量大于50 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算术
平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。
试样中核黄素经酸性溶液超声提取后，经离心、过滤后的试样溶液注入高效液相色谱仪反相色谱系
统中进行分离，用紫外检测器(二极管矩阵检测器)或荧光检测器检测，外标法计算维生素
B₂ 的含量。
除特殊说明外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水，色谱用水为去离子水，符合
GB/T 6682 中一级
用水规定。
GB/T 14701—2019
4.2.1 二水合乙二胺四乙酸二钠(EDTA): 优级纯。
4.2.2 庚烷磺酸钠(PICB₇): 优级纯。
4.2.7 提取液：在1000 mL 容量瓶中，称50 mg (精确至0.001 g)EDTA(4.2.1),
加入约700 mL 去离子 水，超声使 EDTA 完全溶解。加入25 mL 冰乙酸(4.2.4)、5
mL 三乙胺(4.2.5),用去离子水定容至刻度 摇匀。
4.2.8 磷酸二氢钠溶液：称取3.9g 磷酸二氢钠，溶于1000 mL
去离子水，过膜备用。
4.2.9 流动相I: 在1000 mL 容量瓶中，称入50 mg (精确至0.001
g)EDTA(4.2.1)、1.1 g(精确至 0.001 g) 庚烷磺酸钠(4.2.2),加入约700 mL
去离子水，超声使固体全部溶解。加入25 mL 冰乙酸 (4.2.4)、5mL
三乙胺(4.2.5),用去离子水定容至刻度摇匀。用冰乙酸、三乙胺调节该溶液 pH 至
3.70±0.10,过0.45 μm 滤膜。取该溶液800 mL 与200 mL
甲醇(4.2.6)混合，超声脱气，备用。
4.2.10 维生素 B₂ 标准溶液
4.2.10.1 维生素 B2
标准贮备液：称取在五氧化二磷干燥器里干燥24 h 的维生素 B₂ (纯度大于95%)
10 mg(精确至0.0001 g)于250 mL 锥形瓶中，加1 mL
冰乙酸(4.2.4)在沸水浴煮沸30 min, 待固体颗
粒完全溶解，取出冷却至室温后转移入250 mL
棕色容量瓶中，用去离子水定容至刻度。此溶液中维生 素 B₂ 浓度为50μg/mL,
置于冰箱2℃~8℃保存，可使用6个月。
4.2.10.2 维生素 B2
标准工作液：测定维生素预混合饲料样品，可直接使用维生素 B2 标准贮备液
4.2.10.1
mL 维 生素 B₂ 标准贮备液(4.2.10.1)于50 mL
棕色容量瓶中，用提取液定容至刻度。该标准工作液中维生素 B₂ 浓度为5μg/mL,
分析前稀释备用。
4.3.1 高效液相色谱仪：带紫外检测器(二极管矩阵检测器)或荧光检测器。
4.3.2 pH 计：带温控，精度0.01。
4.3.3 恒温水浴锅：0℃~100℃。
4.3.4 针头过滤器：备0.45 μm 水系滤膜。
按 GB/T14699.1 的规定采样，选取有代表性的饲料样品至少500 g,
四分法缩减至100 g; 按 GB/T 20195 的规定制备样品，磨碎，全部通过0.425 mm
孔筛，混匀，装入密闭容器中，避光低温保存
备用。
以下操作应避免强光照射。
称取维生素预混合饲料试样0.25 g～0.50 g(精确至0.0001
g)或复合预混合饲料、浓缩饲料2 g～3g (精确至0.001 g), 于100 mL
棕色锥形瓶中，加入约70 mL 的提取液(4.2.7)于100℃水浴中煮沸 30
min～40min,最初的几分钟里，摇动锥形瓶以防止固体结块。待冷却后，转移至100
mL 棕色容量
瓶中，用提取液定容至刻度，混匀、过滤。对于维生素预混合饲料，需要使用提取液进一步稀释5～10倍。
GB/T 14701—2019
上液相色谱仪测定前所有试液均需经0.45μm 滤膜(4.3.4)过滤。
4.5.2.1 高效液相色谱参考条件I
色谱柱：Cis, 长250 mm, 内径4.6 mm, 粒度5 μm, 或性能相当的Cis 柱。
流动相：见4.2.9。
流速：1.0 mL/min。
柱温：25℃~28℃。
进样体积：10 μL～20μL。
检测器：紫外或二极管矩阵检测器。
波长：267 nm。
4.5.2.2 高效液相色谱参考条件Ⅱ
色谱柱：Cis, 长250 mm, 内径4.6 mm, 粒度5 μm, 或性能相当的Cis 柱。
流动相：A: 磷酸二氢钠溶液(4.2.8);B: 甲醇，梯度淋洗，见表1。
流速：1.0 mL/min;
柱温：25℃~28℃。
进样体积：10μL～20μL。
检测器：荧光检测器激发波长440 nm; 发射波长525 nm。
表 1 流动相梯度淋洗表
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4.5.2.3 定量测定
色谱柱注入维生素 B₂ 标准贮备液(4.2.10.1)或者维生素 B₂
标准工作液(4.2.10.2)和试样溶液(4.5.1),
得到色谱峰面积的响应值，用外标法定量测定，维生素 B₂ 色谱图参见附录 A。
试样中维生素 B₂ 的含量 wi 以质量分数表示，单位为毫克每千克(mg/kg),
按式(2)计算：
style="width:2.81343in;height:0.68002in" /> (2)
式中：
A;—— 试样溶液峰面积值；
V — 试样稀释体积，单位为毫升(mL);
GB/T 14701—2019
c — 标准溶液浓度，单位为微克每毫升(μg/mL);
Vsu— 标准溶液进样体积，单位为微升(μL);
Ai— 标准溶液峰面积平均值；
V,— 试样溶液进样体积，单位为微升(μL);
m — 试样质量，单位为克(g);
测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。
对于维生素 B₂ 含量大于5 mg/kg 而小于1000 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立
测定结果与其算术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的10%;
对于维生素 B₂ 含量大于1000 mg/kg
的饲料，在重复性条件下，获得的两次独立测定结果与其算
术平均值的差值不大于这两个测定值算术平均值的5%。
style="width:7.5199in;height:3.67994in" />GB/T 14701—2019
(资料性附录)
维生素 B₂ 标准色谱图
液相色谱紫外检测色谱条件下维生素 B₂ 标准色谱图见图
A.1,液相色谱荧光检测色谱条件下维生
素 B₂ 标准色谱图见图 A.2。
AU
图 A.1 液相色谱紫外检测色谱条件下维生素 B₂
标准色谱图(维生素 B₂ 浓度为2μg/mL)
style="width:6.36681in;height:3.48018in" />
图A.2 液相色谱荧光检测色谱条件下维生素 B₂ 标准色谱图(维生素 B₂
浓度为12μg/mL)
更多内容 可以 GB-T 14701-2019 饲料中维生素B2的测定. 进一步学习